Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Diğer Yayınlar Koleksiyonu
https://hdl.handle.net/20.500.12294/217
Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümüne ait diğer yayınlar bu koleksiyonda listelenir.
2024-03-28T18:28:53Z
-
Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics
https://hdl.handle.net/20.500.12294/3912
Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics
Usman, Sani Sharif; Uba, Abdullahi Ibrahim; Christina, Evangeline
Bacteriophages (phages) are viruses that mainly infect bacteria and are ubiquitously distributed in nature, especially to their host. Phage engineering involves nucleic acids manipulation of phage genome for antimicrobial activity directed against pathogens through the applications of molecular biology techniques such as synthetic biology methods, homologous recombination, CRISPY-BRED and CRISPY-BRIP recombineering, rebooting phage-based engineering, and targeted nucleases including CRISPR/Cas9, zinc-finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Management of bacteria is widely achieved using antibiotics whose mechanism of action has been shown to target both the genetic dogma and the metabolism of pathogens. However, the overuse of antibiotics has caused the emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria which account for nearly 5 million deaths as of 2019 thereby posing threats to the public health sector, particularly by 2050. Lytic phages have drawn attention as a strong alternative to antibiotics owing to the promising efficacy and safety of phage therapy in various models in vivo and human studies. Therefore, harnessing phage genome engineering methods, particularly CRISPR/Cas9 to overcome the limitations such as phage narrow host range, phage resistance or any potential eukaryotic immune response for phage-based enzymes/proteins therapy may designate phage therapy as a strong alternative to antibiotics for combatting bacterial antimicrobial resistance (AMR). Here, the current trends and progress in phage genome engineering techniques and phage therapy are reviewed.
2023-01-01T00:00:00Z
-
İnsan p60-katanin Proteininin, Bitki RIC1 ve İnsan Homoloğu Kiaa1432 Proteinleri ile Etkileşiminin Tespiti & Etkileşimin Mikrotubuller Üzerinde Fonksiyonel Analizi
https://hdl.handle.net/20.500.12294/3853
İnsan p60-katanin Proteininin, Bitki RIC1 ve İnsan Homoloğu Kiaa1432 Proteinleri ile Etkileşiminin Tespiti & Etkileşimin Mikrotubuller Üzerinde Fonksiyonel Analizi
Korulu, Şirin Koç; Selçuk, İlke; Kurtoğlu, Ceren
Mikrotubuller ihtiyaç durumuna göre uzayıp–kısalabilen, yeniden organize olabilen dinamik
yapılı polimerlerdir. Mikrotubul organizasyonu, bölünen hücrelerde mitoz, post-mitotik
nöronlarda akson/dendrit yapılarının oluşumunda görevlidir. Mikrotubul organizasyonuna
imkan sağlayan mekanizmalardan birisi Katanin gibi mikrotubul kesici proteinlerce
kesilmeleridir. Katanin, KATNA1 geni tarafından kodlanan ve enzimatik aktiviteye sahip p60,
onun fonksiyonunu düzenleyen ve KATNB1 geni tarafından kodlanan p80 alt birimlerinde
oluşmaktadır.
Katanin’in bilinen regülatörleri, etkileşim partnerleri yok denecek kadar azdır. Arabidopsis
thaliana bitkisinde yapılan çalışmalarda p60-katanin’in bir GTPase olan RIC1 proteini ile
etkileştiği ve p60-katanin’in enzimatik aktivitesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçtan
hareketle, önerilen proje ile insan p60-katanin proteininin, bitki RIC1 ve insan homoloğu
Kiaa1432 proteinleri ile fiziksel etkileşiminin tespiti ve etkileşimin mikrotubul kesimi bakımından
fonksiyonel açıdan aydınlatılması amaçlanmıştır.
Proteinlerin etkileşim bakımından incelenebilmesi adına ilk olarak bu proteinleri kodlayan
cDNA’lar FLAG ve His eki içeren plazmidlere ayrı ayrı klonlanmışlardır. Arabidopsis thaliana
p60-katanin ve RIC1 proteinleri Prof. Ying Fu tarafından temin edilmiş olup sadece ilgili
plazmidlere aktarılmışlardır. İnsan p60-katanin yürürlükte olan 114Z971 projesi kapsamında
FLAG ekli olarak elde edilmiş olup insan Kiaa1432 proteinini kodlayan cDNA klonlanmıştır.
Klonlamayı takiben proteinler fiziksel etkileşim bakımından ko-immün çöktürme yöntemiyle test
edilmiştir. Son olarak, His ve FLAG ekli olarak klonlanan proteinlerin cDNA’larını içeren
plazmidler farklı kombinasyonlar halinde hücreye verilmek suretiyle olası etkileşimin mikrotubul
ağına etkisi araştırılmıştır.
Yapılan analizlerin sonucunda insan p60-katanin’in Arabidopsis thaliana RIC1 ve bu proteinin
insan homoloğu Kiaa1432 proteinleri ile fiziksel etkileşimine rastlanamamıştır.
2023-01-01T00:00:00Z
-
Aktif Bölge Mimarisinin Anlaşılması Temelinde, NAD + Bağımlı Mutant Candida methylica Format Dehidrogenaz Enziminin Spesifik Aktivitesinin Arttırılması
https://hdl.handle.net/20.500.12294/3852
Aktif Bölge Mimarisinin Anlaşılması Temelinde, NAD + Bağımlı Mutant Candida methylica Format Dehidrogenaz Enziminin Spesifik Aktivitesinin Arttırılması
Binay, Barış; Torun, Soner
Format dehidrogenaz enzimi (FDH), endüstriyel biyokatalizörler arasında son yıllarda en çok
dikkat çeken enzimlerden biridir. Özellikle NAD(P)+ bağımlı FDH, gerçekleştirdiği
reaksiyonun düşük redoks potansiyeli nedeniyle biyoenerji üretimi ve saf kiral bileşiklerin
sentezi sırasında ihtiyaç duyulan sürekli NAD(P)H yenilenmesinin sağlanması için en çok
başvurulan enzimlerdendir. Endüstriyel biyoteknoloji için, NAD(P)+ bağımlı FDH’ın en büyük
dezavantajı mevcut FDH’ların (FDHs) düşük aktiviteye sahip olmasıdır. Bu nedenle özellikle
endüstriyel ölçekte biyokatalitik yöntemlerle değerli farmasötik saf kiral ara bileşiklerin sentezi
için gerekli olan sürekli NAD(P)H’nin yenilenmesinde FDH enziminin kullanılması oldukça
yüksek maliyetlidir.
Proje başvurusu öncesinde ön çalışma olarak literatürde rapor edilen ısıl kararlılığı arttırılmış
Candida methylica (Cm) mutant FDH’ın yapısı analiz edilmiştir. Bunun için, öncelikle Cm
FDH’ın homoloji yöntemi ile yapısı tahmin edilmiş ve elde edilen yapı moleküler dinamik ile
optimize edilmiştir. Sonra diğer kaynaklardan elde edilen FDH enzimlerin dizileri ve yapıları
ile karşılaştırılarak; Cm FDH için katalitik bölgeyi oluşturan, formik asit-NAD+ bağlanma
bölgesini oluşturan amino asit pozisyonları tahmin edilmiştir. Enzimin aktif bölgesini
oluşturduğu yada katalitik aktivitesinde etkili olabileceği tahmin edilen Thr67, Phe69, Gly92,
Val93, Gly94, Asp96, Arg258, Gln287, His311 dokuz (9) amino asit, ISM yönteminin CAST
tekniği için aday amino asit pozisyonları olarak belirlenmiştir.
Projenin kabulu sonrası ilk iş olarak, hesapsal yöntemler ve literatür bilgisi ile belirlenen
fonksiyonel amino asit pozisyonları için ISM/CAST ile mutant kütüphanesi oluşturulmuştur.
Petri platelerde oluşturulan her mutant kütüphanesi için 20-50 arasında koloni elde edilmiştir.
Oluşturulan mutant kütüphaneleri, substrat olarak NAD+ ve formik asite karşı yüksek spesifik
aktiviteye sahip mutant FDH’ı seçmek için taranmıştır. Tarama sonucu 13 tane mutant
koloninin aktif olduğu gözlemlenmiştir. Seçilen substratlara karşı doğal tip Cm FDH ile
karşılaştırıldığında spesifik aktivitesi yüksek olan mutant FDH’lar seçilerek, dizi ananlizi için
dizilemeye gönderilmiştir. Dizileme sonucu aktif olan 13 mutanttan sadece 3 tanesinde baz
değişimi olduğu görülmüştür. Bunlardan 2 tanesinde sessiz mutasyon, diğerinde ise N119R
değişimi tespit edilmiştir. TAGZyme sistemi ile saflaştırılmış ve yabanıl tip ve mutant enzimin
kinetik değerleri sırasıyla format ve NAD+’ye karşı KM 11,20 ve 0,95 mM, kcat 22,21 ve
54,56 s-1
olarak belirlenmiştir. Büyük yan zincirden kaynaklı substratlara ev sahipliği yapan
119. pozisyon için yerinin daha az su ile dolması ve substratlar ile daha çok etkileşmesi
seçilen substratlar için KM değerinde iyileşmeye neden olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca,
Arg119’a ait geniş hacimli yan zinciriyle His311’e hidrit transferinin kolaylaşması kcat’in
artmasına yol açtığı düşünülmektedir.
vii
Son olarak elde edilen mutant FDH enziminin substrat ile olan etkileşimleri, moleküler
dinamik simülasyonuyla elde edilen yapıda incelenmiştir. Modelleme çalışmaları sonuçları
göstermektedir ki; Arg119 mutasyonu iki monomerin birleşme noktasında olan Phe69
üzerinden yapısal değişikliklere yol açmaktadır. Bu mutasyonun, NAD+ ile bağlanmayı
güçlendiren etkilere sahip olduğu iyileşen kinetik değerlerden dolayı da tahmin edilmektedir.
Elde edilen yapı göstermektedir ki; arjinin sahip olduğu uzun yan zincir ile substratların doğru
yönde yönlendirilmesini, hidrit iyonunun formik asitten His311’e daha hızlı transfer olmasını
sağlamakta ve iyileşen KM ve kcat değerleri bu varsayımları desteklemektedir.
Proje sonunda; NAD+ ve formata karşı yaklaşık %10 katalitik aktivitesi arttırılmış, karakterize
edilmiş, ısıya dayanıklı mutant FDH enzimi tanımlanmıştır. 119. pozisyondaki Asn, Arg ile yer
değiştirmesi, substratların katalitik bölgeye daha iyi yönelmesini sağlamıştır. Arg, Asn gibi
karboksilat grubu üzerinden substratları koordine etmiştir. Yüksek katma değerli endüstriyel
biyokatalizör olarak aktivitesi yüksek olan mutant FDH enziminin patentlenmesi
planmaktadır.
2023-01-01T00:00:00Z
-
Gene therapy in haemophilia: literature review and regional perspectives for Turkey
https://hdl.handle.net/20.500.12294/3071
Gene therapy in haemophilia: literature review and regional perspectives for Turkey
Kavakli, Kaan; Antmen, Bulent; Okan, Vahap; Sahin, Fahri; Aytac, Selin; Balkan, Can; Berber, Ergul; Kaya, Zuhre; Kupesiz, Alphan; Zulfikar, Bulent
Haemophilia is an X-linked lifelong congenital bleeding disorder that is caused by insufficient levels of factor VIII (FVIII; haemophilia A) or factor IX (FIX; haemophilia B) and characterized by spontaneous and trauma-related bleeding episodes. The cornerstone of the treatment, factor replacement, constitutes several difficulties, including frequent injections due to the short half-life of recombinant factors, intravenous administration and the risk of inhibitor development. While extended half-life factors and subcutaneous novel molecules enhanced the quality of life, initial successes with gene therapy offer a significant hope for cure. Although adeno-associated viral (AAV)-based gene therapy is one of the most emerging approaches for treatment of haemophilia, there are still challenges in vector immunogenicity, potency and efficacy, genotoxicity and persistence. As the approval for the first gene therapy product is coming closer, eligibility criteria for patient selection, multidisciplinary approach for optimal delivery and follow-up and development of new pricing policies and reimbursement models should be concerned. Therefore, this review addresses the unmet needs of current haemophilia treatment and explains the rationale and principles of gene therapy. Limitations and challenges are discussed from a global and national perspective and recommendations are provided to adopt the gene therapies faster and more sufficient for the haemophilia patients in developing countries like Turkey. © The Author(s), 2022.
2022-01-01T00:00:00Z